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small RNA測序+tsRNA分析助力揭示增生性瘢痕發生機制

2020-03-20


發表期刊:International Journal of Molecular Medicine

影響因子:2.9

文章題目:tRNA?derived small RNAs: A novel class of small RNAs in human hypertrophic scar fibroblasts

技術手段:small RNA-Seq


派森諾生物與南昌大學第一附屬醫院攜手合作,于近期在《International Journal of Molecular Medicine》上發表了tsRNA在人增生性瘢痕纖維細胞中的差異表達相關研究。


研究背景

增生性瘢痕是一種創傷修復過程中由于細胞外基質過度沉積、纖維細胞過度增殖導致的異常疤痕,它表面突出,潮紅充血,質地實韌,有灼痛和瘙癢感,不僅會損害皮膚的外觀和功能,更影響患者的心理和生理。然而目前增生性瘢痕形成的分子機制尚無定論。

tsRNA(tRNA?derived small RNAs)是一類來自tRNA的短片段,它不僅是隨機tRNA裂解的副產物,更可作為一種小的非編碼RNA在許多特定的生理和病理過程中發揮關鍵作用。

基于此,本研究通過small RNA測序,分析增生性瘢痕纖維細胞中發生差異表達的tsRNA,并通過功能富集分析、共表達網絡分析、ceRNA分析等方法推測tsRNA在增生性瘢痕形成過程中發揮的作用。


研究方法

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研究結果

1、差異tsRNA及其功能富集分析

測序結果顯示,相較于對照細胞,增生性瘢痕組織的細胞中共檢測到67個差異表達的tsRNA,其中27個上調表達,40個下調表達(圖1)。

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圖1 差異表達tsRNA的熱圖


為探討這些差異tsRNA在增生性瘢痕中的潛在作用,進一步對其靶基因進行功能富集分析。GO富集分析顯示,差異tsRNA的靶基因富集于多種生物學功能相關條目,包括“神經系統發育”、“細胞粘附”、“局灶性粘附”、“蛋白結合”、“血管生成”和“肌動蛋白結合”(圖2 A-C),暗示這些基因可能參與細胞分裂和增殖;KEGG富集分析表明,變化最顯著通路中包括“Ras信號通路”、“Rap1信號通路”和“cGMP-PKG信號通路”(圖2 D),說明這些基因可能在細胞增殖、分化、轉移和凋亡中發揮重要作用。

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圖2 差異tsRNA靶基因的GO和KEGG富集分析


2、關鍵tsRNA的靶基因預測

從上調表達的tsRNA中發現3個關鍵tsRNA:tsRNAs-23678、tsRNA-23727和tsRNA-23761,它們都屬于5’-tsRNA類,而已有研究表明5’-tsRNA可以調節干細胞的分化,并參與翻譯抑制,因此重點關注這3個tsRNA的靶基因(表1)。結果顯示,tsRNA-23761的靶基因包含COL1A1,該基因可編碼膠原蛋白COL1的前體,該蛋白的異常積累導致瘢痕形成,已有研究表明COL1在增生性瘢痕中上調表達。無獨有偶,tsRNA-23727和tsRNAs-23678的靶基因均包含SMAD2,而該基因可調控包括增殖、存活、凋亡和休眠在內的多種細胞活動,也被證實在增生性瘢痕纖維細胞中的顯著上調表達。這些結果均顯示,tsRNA在增生性瘢痕纖維細胞中的功能可能涉及關鍵mRNA的正向調控。

表1 關鍵差異tsRNA的靶基因預測

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3、tsRNA-miRNA共表達網絡分析

由于大多數tsRNAs目前沒有注釋,其功能多是通過共表達的miRNA的功能進行推測,因此選擇3個關鍵tsRNA:tsRNAs-23678、tsRNA-23727和tsRNA-23761,構建tsRNA-miRNA共表達網絡(圖3)。結果顯示,共有40個miRNA與這三個tsRNA相關,其中包含已被證實與增生性瘢痕相關的miRNA,如miR-29b:共表達網絡顯示,tsRNA-23678與miR-29b家族成員miR -29b-1-5p互作,且轉錄組測序結果顯示二者表達趨勢相反,暗示tsRNA?23678可能是增生性瘢痕的重要調節因子。

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圖3 關鍵tsRNA-miRNA共表達網絡分析


4、tsRNA-miRNA-mRNAceRNA網絡分析

已知miRNA通過與mRNA結合而導致基因沉默,而tsRNA可能通過與miRNA競爭性結合來調節基因表達,基于此構建tsRNA-miRNA-mRNA的ceRNA網絡(圖4),該網絡由3個tsRNA、6個miRNA和40個mRNA組成。其中,tsRNA-23761是miR-3135b的一個ceRNA,它以血管緊張素轉換酶(ACE)和PYGO2為靶點,而ACE在創面愈合和膠原生成過程中起著重要的中介作用。因此可推測,tsRNA-23761與miRNA競爭以調控ACE表達,從而影響增生性瘢痕纖維細胞的活性和增殖。

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圖4 tsRNA-miRNA-mRNA的ceRNA網絡圖


結 論

本研究通過small RNA測序,首先鑒定出增生性瘢痕組織與正常皮膚組織相比差異表達的tsRNA,并通過靶基因的功能富集分析證實差異tsRNA的功能與增生性瘢痕有關;然后明確差異tsRNA中的tsRNA-23678、tsRNA-23727和tsRNA-23761為關鍵tsRNA,并以它們為中心構建共表達網絡和ceRNA網絡。最后提出tsRNA調控增生性瘢痕的機制:tsRNA-23678可能通過與miR29b15p相互作用而發揮關鍵作用;tsRNA-23761可能作為競爭性的內源RNA與miR-3135b結合,最終調節靶基因ACE的表達。


本研究有助于揭示增生性瘢痕的分子機制,并為其治療提供理論基礎。


文章小結

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本研究的測序工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。


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